Za zdravstvene radnike
Preanalitika i čuvanje tkiva
Uspjeh NGS testa odlučuje se prije laboratorije: od vremena do formalina i fiksacije do izbora bloka i štednje tkiva kod malih biopsija.
1. Zašto preanalitika odlučuje o nalazu
Najveći dio neuspjelih ili neinformativnih NGS testova ne nastaje u sekvenceru, nego u satima nakon biopsije: u vremenu do fiksacije, u formalinu, u dekalcifikaciji i u izboru bloka. Te korake ne može ispraviti nijedna kasnija laboratorijska metoda.
Preanalitička faza obuhvata sve od uzimanja uzorka do početka ekstrakcije nukleinskih kiselina. Fragmentacija DNK, deaminacija citozina uzrokovana formalinom (lažni C>T/G>A artefakti) i razgradnja RNK direktno smanjuju osjetljivost za fuzije, promjene broja kopija i varijante niske alelne frekvencije [1][3].
Ključna poruka
Ako se zna da će tumor vjerovatno trebati molekularno testiranje (npr. uznapredovali NSCLC, kolorektalni karcinom, karcinom nepoznatog primarnog sijela), preanalitika se planira već pri indikaciji za biopsiju — ne nakon dijagnoze.
2. Hladna ishemija i fiksacija
Hladna ishemija (vrijeme od odstranjenja tkiva do uranjanja u fiksativ) treba biti što kraća, idealno do 1 sat. Standardni fiksativ je 10% neutralni puferirani formalin, u volumenu najmanje 10 puta većem od volumena tkiva. ASCO/CAP smjernice za ER/PR i HER2 kod karcinoma dojke propisuju fiksaciju 6–72 sata; isti raspon prihvaćen je kao praktičan standard i za molekularno testiranje [1][2].
| Parametar | Preporuka | Posljedica odstupanja |
|---|---|---|
| Hladna ishemija | ≤1 h | Razgradnja RNK, gubitak fosfoproteina, slabiji IHC |
| Fiksativ | 10% neutralni puferirani formalin | Nepuferirani ili kiseli fiksativi oštećuju DNK |
| Volumen fiksativa | ≥10:1 u odnosu na tkivo | Nepotpuna fiksacija središnjih dijelova |
| Trajanje fiksacije | 6–72 h | Prekratko: slaba morfologija; predugo: jača fragmentacija DNK |
| Alternativni fiksativi | Izbjegavati Bouin, B5, Zenker | Teški metali i pikrinska kiselina degradiraju DNK |
3. Dekalcifikacija
Jake kiseline (HCl, dušična kiselina) i brzi kiseli dekalcifikatori hidrolizuju DNK i praktično onemogućavaju NGS. Kod koštanih metastaza preporučuje se EDTA dekalcifikacija ili, kada je moguće, odvajanje mekotkivne komponente za molekularno testiranje bez dekalcifikacije [3][4].
- Na uputnici jasno naznačiti da je potrebno molekularno testiranje — patolog tada bira EDTA.
- Ako postoji vanskeletna lezija, ona je obično bolji izvor tkiva od koštane metastaze.
- Kod uzorka dekalcificiranog kiselinom, tečna biopsija je često razumnija alternativa od ponovnog pokušaja na istom bloku.
4. Izbor bloka i tumorska čistoća
Patolog bira blok s najvećim udjelom vitalnog tumora, najmanje nekroze, mucina i upalnih ćelija. Tumorska čistoća (neoplastična celularnost) procjenjuje se na H&E preparatu i navodi u izvještaju; makrodisekcija označenog područja povećava udio tumorske DNK [3][5].
| Pokazatelj | Orijentacioni prag | Napomena |
|---|---|---|
| Tumorska čistoća | Tipično ≥20% (minimum zavisi od testa) | Ispod praga raste rizik lažno negativnog nalaza, posebno za CNV i homozigotne delecije |
| Površina tkiva | Prema specifikaciji laboratorije (često ≥25 mm² ukupno) | Mala površina može se nadoknaditi većim brojem rezova |
| Nekroza | Što manja | Nekrotično tkivo daje degradiranu DNK |
Praktično
Prije slanja provjerite zahtjeve konkretne laboratorije (broj nebojenih rezova, debljina, čistoća). Za FoundationOne CDx specifikacije su navedene u uputi za uzorke proizvođača.
5. Štednja tkiva kod malih biopsija
Kod malih biopsija (core, endobronhalne, EBUS) svaki rez je dragocjen. CAP/IASLC/AMP smjernice za karcinom pluća preporučuju da se dijagnostički IHC ograniči na minimum potreban za klasifikaciju, kako bi preostalo tkivo bilo dostupno za molekularno testiranje [4].
- Uzeti više cilindara već pri biopsiji (npr. 3–4 kod sumnje na uznapredovali NSCLC) i rasporediti ih u više blokova.
- Pri prvom rezanju pripremiti rezervne nebojene rezove („tissue-sparing“ protokol) da se izbjegne ponovno poravnavanje bloka.
- Koristiti ograničen dijagnostički IHC panel (npr. TTF-1 i p40 kod NSCLC).
- Uvesti refleksno testiranje po protokolu ustanove, kako bi uzorak odmah otišao na NGS.
6. Citološki uzorci i starost blokova
Citološki uzorci (ćelijski blokovi, razmazi, tekućina iz izljeva) mogu biti adekvatni za NGS ako imaju dovoljno tumorskih ćelija, a alkoholna fiksacija razmaza čuva DNK bolje od formalina. Korištenje ovisi o validaciji testa u laboratoriji; mnogi komercijalni testovi primaju samo FFPE materijal [4][5].
Kvalitet DNK u FFPE blokovima opada s godinama skladištenja, posebno u toplim i vlažnim uvjetima. Blokovi stari nekoliko godina često su upotrebljivi, ali noviji blok i noviji uzorak bolje odražavaju trenutni molekularni profil — što je važno nakon ciljane terapije [3].
7. Kada tkivo nije dovoljno — i kontrolna lista
Kada je tkivo neadekvatno ili iscrpljeno, ESMO preporuke podržavaju ctDNA testiranje kao validnu alternativu u uznapredovaloj bolesti, uz svijest o nižoj osjetljivosti kod niskog izlučivanja tumorske DNK; negativan ctDNA nalaz opravdava tkivnu rebiopsiju [6][7].
- Uputnica navodi kliničku indikaciju i potrebu za molekularnim testiranjem.
- Zabilježeno vrijeme hladne ishemije i trajanje fiksacije.
- Bez kisele dekalcifikacije (ili navedena EDTA).
- Patolog označio područje tumora i naveo tumorsku čistoću.
- Broj i debljina rezova prema zahtjevu laboratorije.
- Pri neadekvatnom tkivu: razmotriti tečnu biopsiju paralelno ili refleksno.
8. Reference
- [1] Wolff AC, Somerfield MR, Dowsett M, et al. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: ASCO–College of American Pathologists Guideline Update. J Clin Oncol. 2023;41(22):3867-3872. Izvor
- [2] Allison KH, Hammond MEH, Dowsett M, et al. Estrogen and Progesterone Receptor Testing in Breast Cancer: ASCO/CAP Guideline Update. J Clin Oncol. 2020;38(12):1346-1366. Izvor
- [3] Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, et al. Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing–Based Oncology Panels: A Joint Consensus Recommendation of AMP and CAP. J Mol Diagn. 2017;19(3):341-365. Izvor
- [4] Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, et al. Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: CAP/IASLC/AMP Guideline. J Mol Diagn. 2018;20(2):129-159. Izvor
- [5] Mosele MF, Westphalen CB, Stenzinger A, et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with advanced cancer in 2024: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Ann Oncol. 2024;35(7):588-606. Izvor
- [6] Pascual J, Attard G, Bidard FC, et al. ESMO recommendations on the use of circulating tumour DNA assays for patients with cancer. Ann Oncol. 2022;33(8):750-768. Izvor
- [7] Rolfo C, Mack P, Scagliotti GV, et al. Liquid Biopsy for Advanced NSCLC: A Consensus Statement From the International Association for the Study of Lung Cancer. J Thorac Oncol. 2021;16(10):1647-1662. Izvor
Odricanje odgovornosti. Sadržaj na ovoj stranici služi isključivo u edukativne svrhe i ne zamjenjuje pregled, dijagnozu, terapijsku preporuku ili razgovor s kvalificiranim zdravstvenim radnikom.