NGS — sve na jednom mjestu

1. Uvod — mjesto NGS-a u dijagnostičkom putu

Sekvenciranje nove generacije (NGS) omogućava paralelnu analizu velikog broja gena iz jednog uzorka i danas je standard za utvrđivanje terapijski relevantnih (actionable) promjena kod uznapredovalih solidnih tumora.

ESMO preporučuje rutinsku upotrebu multigenskog NGS-a na uzorcima tumora kod uznapredovalog nemikrocelularnog karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma prostate, kolorektalnog karcinoma, karcinoma bilijarnog trakta i kod tumora jajnika, jer u tim indikacijama postoji dovoljno terapijskih ciljeva da panel bude troškovno opravdan u odnosu na niz pojedinačnih testova [1].

Sveobuhvatno genomsko profiliranje (CGP) obuhvata stotine gena i, uz mutacije i kopije gena, istovremeno daje potpisne biomarkere imunoterapije — mikrosatelitsku nestabilnost (MSI) i tumorsko mutacijsko opterećenje (TMB). Sekvencijalno testiranje pojedinačnih markera troši tkivo i vrijeme; jedan sveobuhvatni test smanjuje rizik da uzorak bude iscrpljen prije nego što se dođe do ključnog nalaza [1][2].

2. DNA paneli — od hotspota do sveobuhvatnog profiliranja

DNA paneli se razlikuju po širini (broj gena i tip pokrivenosti) i po dubini očitanja. Hotspot paneli pokrivaju samo poznate mutirane kodone i jeftini su, ali propuštaju indele izvan hotspota, delecije, amplifikacije i strukturne varijante. Sveobuhvatni paneli pokrivaju cijele kodirajuće regije odabranih gena plus introne relevantne za fuzije.

Dubina očitanja određuje granicu detekcije (LoD). Za tkivne panele klinički validirana dubina je najčešće u rangu nekoliko stotina do >500× srednje pokrivenosti, što omogućava pouzdanu detekciju varijanti s alelnom frakcijom oko 5 %; niža tumorska celularnost proporcionalno podiže prag na kojem se varijanta može pouzdano pozvati. Validacijski parametri (analitička senzitivnost, specifičnost, LoD po tipu varijante, reproducibilnost) moraju biti navedeni u izvještaju laboratorije i usklađeni sa smjernicama za validaciju NGS panela [3].

• TMB i MSI iz panela zahtijevaju dovoljnu veličinu ciljane regije i harmonizirane granične vrijednosti — vrijednosti nisu izravno usporedive među platformama.
• Amplifikacije (npr. ERBB2, MET, FGFR1) traže algoritam za kopije s korekcijom na tumorsku celularnost; nizak udio tumora vodi u lažno negativan nalaz.
• Bez uparenog normalnog uzorka dio germline varijanti ostaje u izvještaju kao vjerojatno germline — takav nalaz zahtijeva potvrdno germline testiranje.

3. RNA paneli i detekcija fuzija

Fuzijski geni su terapijski ciljevi prvog reda, ali su DNA panelima najteže dostupni: prijelomne tačke često leže u vrlo velikim intronima ili repetitivnim regijama, a partner gen može biti nepoznat. RNA-bazirani pristupi (anchored multiplex PCR, hibridizacijsko hvatanje na cDNA) očitavaju spojni transkript i time detektiraju fuziju bez obzira na intronsku prijelomnu tačku i bez pretpostavke o partneru [4].

• ALK, ROS1, RET, NTRK1/2/3, FGFR2/3, NRG1 — fuzije s odobrenim ili smjernicama podržanim ciljanim terapijama.
• MET exon 14 skipping nastaje mutacijama u splice regijama; RNA analiza direktno potvrđuje preskočeni egzon, dok DNA analiza traži interpretaciju splice varijante.
• Kod NSCLC bez drivera na DNA panelu, refleksni RNA panel povećava udio pacijenata s pronađenim terapijskim ciljem — negativan DNA nalaz ne isključuje fuziju [4].

4. Tečna biopsija (ctDNA) — kada i kako

ESMO preporučuje validirane ctDNA testove kod uznapredovale bolesti kada je potreban brz rezultat, kada tkivo nije dostupno ili je nedovoljno, te za detekciju rezistencijskih mehanizama pri progresiji na ciljanoj terapiji [5].

• Pozitivan ctDNA nalaz terapijski relevantne varijante može se koristiti za odluku bez potvrde iz tkiva.
• Negativan ctDNA nalaz ne isključuje promjenu: pri niskoj tumorskoj frakciji (oligometastatska bolest, samo intrakranijalna bolest, indolentna biologija) test je lažno negativan — obavezan je reflex na tkivo.
• Klonalna hematopoeza (DNMT3A, TET2, ASXL1, TP53, ATM, CHEK2) generira varijante porijeklom iz leukocita; interpretacija zahtijeva oprez i, kad je dostupno, sekvenciranje bijelih krvnih stanica.
• Preanalitika: krv u epruvete sa stabilizatorom stanica, obrada u roku koji propisuje proizvođač; kašnjenje razrjeđuje ctDNA genomskom DNK iz lizirane leukocitne frakcije.

5. Kvalitet uzorka i preanalitika

Najčešći uzrok neuspjelog molekularnog testa nije sekvencer nego uzorak. Preanalitički uvjeti određuju hoće li nalaz uopće biti moguć.

• Fiksacija u 10 % neutralnom puferiranom formalinu, tipično 6–48 h; predugačka fiksacija i nepuferirani formalin uzrokuju fragmentaciju i deaminacijske artefakte (C>T).
• Izbjegavati dekalcifikaciju jakim kiselinama (HCl, HNO₃) — koštane metastaze dekalcificirati EDTA otopinom ako se planira molekularna analiza.
• Tumorska celularnost: većina panela traži ≥20 % tumorskih stanica; makrodisekcija označene zone na HE preparatu podiže udio i spašava uzorak.
• Površina i debljina: tipično se traži nekoliko rezova od 5–10 µm s ukupnom tumorskom površinom od nekoliko desetaka mm²; citološki uzorci i cell block su prihvatljivi ako zadovoljavaju celularnost.
• Starost bloka: blokovi stariji od ~3 godine imaju značajno veći udio QC neuspjeha, posebno za RNA analize.
• RNA je osjetljivija od DNA — za fuzijske panele koristiti najsvježiji dostupan materijal.

Recentne analize velikih kliničkih kohorti pokazuju da kvalitet i način obrade uzorka mjerljivo utječu na udio pacijenata kod kojih se uopće dobije terapijski upotrebljiv nalaz — preanalitika je stoga dio kliničke odluke, a ne samo laboratorijski detalj [6].

6. Interpretacija i struktura izvještaja

Somatske varijante se klasificiraju prema zajedničkom konsenzusu AMP/ASCO/CAP u četiri nivoa kliničkog značaja: Tier I (jaki klinički značaj), Tier II (potencijalni klinički značaj), Tier III (varijanta nepoznatog značaja) i Tier IV (benigna ili vjerojatno benigna) [2].

ESMO ljestvica kliničke primjenjivosti molekularnih ciljeva (ESCAT) dodatno rangira odnos cilj–lijek od I-A (validiran cilj, prospektivno potvrđena korist u toj indikaciji) do V i X, i koristi se za komunikaciju snage dokaza na molekularnom tumor boardu [7].

• VUS se ne koristi za terapijske odluke; preporučuje se periodična reanaliza jer se klasifikacija mijenja s novim dokazima.
• Nalazi koji sugeriraju germline predispoziciju (BRCA1/2, MMR geni, TP53, RB1 uz visoku alelnu frakciju) upućuju se na genetsko savjetovanje i potvrdno germline testiranje iz krvi ili brisa sluznice.
• Izvještaj treba sadržavati testiranu regiju, LoD, tumorsku celularnost, verziju baze za anotaciju i eksplicitnu izjavu o tome šta test ne detektira.

7. Praktični algoritam naručivanja

• Uznapredovali NSCLC, prostata, kolorektum, bilijarni trakt, jajnik: CGP iz tkiva pri dijagnozi uznapredovale bolesti [1].
• Nema drivera na DNA panelu, a klinički profil sugerira fuziju (mlađi nepušač, adenokarcinom): dodati RNA fuzijski panel [4].
• Nedovoljno tkiva ili hitna klinička situacija: ctDNA odmah; negativan nalaz obavezno reflektirati na tkivo [5].
• Progresija na ciljanoj terapiji: ctDNA za rezistencijske mehanizme; kod diskordancije razmotriti rebiopsiju.
• Svaki složen ili diskordantan nalaz: molekularni tumor board s dokumentiranom ESCAT/Tier klasifikacijom.